Szerokie spektrum objawów sprawia, że zdiagnozowanie boreliozy nie należy do łatwych zadań. Jedynym znamiennym objawem boreliozy jest rumień wędrujący, który jest wskazaniem do rozpoczęcia antybiotykoterapii, bez konieczności wykonywania badań serologicznych.

Rozpoznanie choroby opiera się na kryteriach klinicznych, przeprowadzonym wywiadzie z chorym oraz dwuetapowej diagnostyce serologicznej. Już sama informacja o pobycie w rejonie endemicznym, możliwych ukąszeniach lub pojawiających się rumieniowych zmianach skórnych znacznie ułatwia ten proces.

Po zebraniu niezbędnych informacji lekarz może zlecić wykonanie testów serologicznych. Przeciwciała mogą się pojawić już w 2.-4. tygodniu po ukąszeniu, jednak u większości chorych ich najwyższe wartości pojawiają się nieco później. Produkcja przeciwciał IgM rozpoczyna się już w 3.-4. tygodniu po ukąszeniu, najwyższe stężenie przypada w 6.-8. tygodniu. Przeciwciała IgG pojawiają się najwcześniej w 4.-6. tygodniu, ze szczytem w 4.-6. miesiącu.

Badania najczęściej rozpoczyna się od testu serologicznego ELISA, którego dodatni (lub wątpliwy) wynik należy potwierdzić badaniem metodą Western-Blot. Przy ujemnym wyniku testu ELISA nie wykonuje się już testu potwierdzenia, gdyż jego zadaniem jest potwierdzenie lub wykrycie fałszywie dodatnich wyników testu ELISA. Ujemny wynik badania Western-Blot (mimo wysokiego poziomu przeciwciał) wyklucza boreliozę. Należy również pamiętać, że u wielu osób, pomimo zakończenia leczenia boreliozy, wysoki poziom przeciwciał może się utrzymywać przez długi czas.